隨著高通量測序技術的成熟，基于孕婦外周血中cffDNA的無創產前篩查技術越來越多應用于胎兒染色體數目異常、單基因疾病檢測及親緣關系的鑒定等。但受檢測技術靈敏度的制約，無創產前篩查技術要達到高效檢測的標準，cffDNA濃度需達到孕婦血漿游離DNA總量的4%以上。因此，了解孕婦血漿游離DNA中的cffDNA濃度對無創產前篩查十分重要。

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《中華婦產科雜志》刊登了一篇《妊娠早期游離DNA濃度研究》的論著，該研究全程由藍沙生物核心技術團隊實驗并撰寫，對孕5-37周的168名單胎正常孕婦進行研究，確證了孕婦血漿cffDNA濃度與孕周的相關性、不依賴父親DNA的孕婦血漿測出cffDNA的可能性。

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01 被試選擇

2014年1月至2017年8月于常州市第二人民醫院就診、孕5-37周的單胎正常孕婦168人。其中孕早期（5-12周）104人，孕中期（13-27周）55人，孕晚期（28-37周）9人，分別占比61.9%、32.7%、5.4%，孕次為（2.0±0.7）次，產次為（0.5±0.6）次，年齡為（32±3）歲。

PS：此次研究經過常州市第二人民醫院倫理委員會批準（批號：[2014]KY010-01），所有孕婦及家屬均知情同意。

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02實驗材料

被試外周血15ml/人、專用采血管[美國STRECK公司產品]、cfDNA提取試劑盒[德國QIAGEN公司產品]、乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管、DNA抽提試劑盒[上海萊楓生物科技有限公司產品]、Qubit3.0熒光計[美國Thermo Fisher公司產品]、二代測序平臺、illumina X-Ten測序平臺。

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03實驗過程

1 使用游離DNA專用采血管采集孕婦15ml外周血，4℃，1600g，離心10min，取清液二次離心，將血漿分裝標記并保存在-80℃冰箱。取1.8ml血漿提取血漿cfDNA。

2 抽取孕婦配偶5ml外周血至EDTA抗凝管，取400μl抽提外周血DNA用于檢測父親SNP位點信息。

3 使用Qubit3.0熒光計對DNA進行定量，使用10ng游離DNA孕婦血漿標本，100ng基因組孕婦配偶血標本分別進行二代測序的文庫構建，采用液相雜交捕獲技術對5800個SNP位點進行目標區域捕獲，使用illumina X-Ten對捕獲的5800個SNP位點進行雙端測序，每端測150個堿基，每個樣本測1000萬條序列。

4 去除接頭和低質量值序列的高通量測序數據，使用序列比對軟件BWA將處理后的測序序列與人類基因組序列參考圖譜進行比對，然后使用samtools軟件獲得5800個SNP位點的分型信息，并計算每個SNP位點的支持序列數。

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04預期結果

1）不依賴父親DNA的孕婦血漿靶向深度測序法檢測出的孕婦血漿cffDNA濃度與依賴父親DNA的孕婦血漿DNA測序法檢測出的孕婦cffDNA濃度一致，具有相關性。

2）孕婦血漿cffDNA濃度與孕周具有相關性。

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05實驗結果

1）74例依賴父親DNA的孕婦血漿DNA測序法檢測出的孕婦cffDNA濃度為（9.1±5.8）%，濃度范圍為1.8%~30.2%；這74例行不依賴父親DNA的孕婦血漿DNA測序法檢測出的孕婦cffDNA濃度為（9.0%±5.7）%，濃度范圍為1.7%~30.1%。

這兩種方法的檢測結果一致，且顯著相關，表明不依賴父親DNA的孕婦血漿靶向深度測序法僅需孕婦血漿即可實現準確的孕婦血漿游離DNA濃度評估，解決了臨床上父親DNA取樣不變的問題。

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2）不依賴父親DNA的孕婦血漿靶向深度測序法檢測168例孕婦血漿的cffDNA濃度為（8.8%±5.1）%，其中孕5周者最低，孕37周者最高，分別占比1.7%、27.2%。此外，孕5~12周、孕13~27周、孕28~27周者的血漿cffDNA濃度分別隨孕周的增加而顯著增加、無顯著變化和顯著增加。孕婦血漿cffDNA濃度≥4%者的比例中，孕13~37周的64例孕婦中，僅有1例孕婦的cffDNA濃度＜4%；孕5~12周的104例孕婦中，cffDNA≥4%孕婦的比例在孕周5~9周隨著孕周增加而顯著增加。

這表明，在孕5周即能檢測到游離DNA，且在孕5~12周隨著孕周的增加而顯著增加，孕13~27周進入平臺期，孕28周后又隨著孕周的增加而升高，這與既往國內外研究結論一致。

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《妊娠早期游離DNA濃度研究》這篇論著為藍沙生物“無創產前親子鑒定孕5周起做”的實力給予了堅實的理論支撐，同時向一直信賴我們的客戶們展示了藍沙強勁的科研能力。

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我們秉持“科研是將領，實踐是士兵”的至理名言，用科學的檢測手段和精湛的檢測技術鑒定每一份送到自有實驗室的樣本，一切為了給予客戶準確無誤的鑒定結論。

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